軟骨細(xì)胞培養(yǎng)指南
20世紀(jì)60年代起人們對(duì)軟骨組織的研究進(jìn)入到細(xì)胞水平。
1967 年 ManningWK 等使用胰蛋白酶聯(lián)合細(xì)菌膠原酶消化分離與培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞獲得成功。
目前人軟骨細(xì)胞體外分離與培養(yǎng)的方法已被廣泛應(yīng)用于軟骨細(xì)胞生物學(xué)研究，為骸骨軟化癥、骨關(guān)節(jié)炎( osteoarthritis ， OA )等疾病的防治及組織工程技術(shù)修復(fù)軟骨缺損等研究提供了重要的方法學(xué)參考。
人軟骨細(xì)胞特點(diǎn)
幼稚的軟骨細(xì)胞位于軟骨組織的表層，單個(gè)分布，體積較小，呈橢圓形，長(zhǎng)軸與軟骨表面平行，越向深層的軟骨細(xì)胞體積之間增大呈圓形，細(xì)胞核圓形或卵圓形，染色淺，細(xì)胞質(zhì)弱嗜堿性，常見(jiàn)數(shù)量不一的脂滴。
成熟的軟骨細(xì)胞多2~8個(gè)成群分布于軟骨陷窩內(nèi)，這些軟骨細(xì)胞由同一個(gè)母細(xì)胞分裂增殖而成，稱(chēng)為同源細(xì)胞群。電鏡下，軟骨細(xì)胞有突起和皺褶，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體及少量的線粒體。在組織切片中，軟骨細(xì)胞收縮為不規(guī)則形，在軟骨囊和細(xì)胞之間出現(xiàn)較大的腔隙。
軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及傳代
圖A為原代細(xì)胞分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞貼壁后的形態(tài)，細(xì)胞呈多角型，扁平狀，胞質(zhì)豐富，可見(jiàn)清晰、圓形的細(xì)胞核，部分區(qū)軟骨細(xì)胞集落樣生長(zhǎng)。
圖B為軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)后的形態(tài)，細(xì)胞似橢圓形，細(xì)胞胞漿豐富。
隨傳代次數(shù)不斷增加，軟骨細(xì)胞集落中的梭形細(xì)胞數(shù)目逐漸增多。
為什么一傳代就變形？
在體外培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞時(shí)，隨著傳代次數(shù)增加軟骨標(biāo)志性蛋白Ⅱ膠原合成分泌減少，而Ⅰ、Ⅲ型膠原合成分泌增多。
Ⅱ膠原的合成和分泌是維持軟骨細(xì)胞分化表型的特征性指標(biāo)，提供了軟骨特有的張力和硬度。
軟骨中的其他分子與膠原蛋白結(jié)合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，支持軟骨具有一定的彈性，對(duì)于軟骨維持形狀及承載外來(lái)負(fù)荷起著非常重要的作用。
所以，隨著傳代次數(shù)的增加，維持細(xì)胞形態(tài)的物質(zhì)會(huì)逐漸減少，細(xì)胞的形態(tài)就會(huì)發(fā)生改變。
這種形態(tài)和功能的變化稱(chēng)之為反分化現(xiàn)象，也是單層傳代細(xì)胞的普遍現(xiàn)象。
軟骨細(xì)胞傳代方法
1. 低密度培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞易發(fā)生去分化現(xiàn)象，一般最適接種密度為2~10×10^4/cm2;
2. 軟骨細(xì)胞代謝較為緩慢，無(wú)需增加換液頻度，可能破壞由細(xì)胞分泌而形成的群體化學(xué)環(huán)境。
傳代步驟
如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
