核酸提取是指將核酸(DNA和RNA)從細胞中提取出來的過程,總的來說包括細胞裂解、核酸純化及后續核酸濃度、純度測定的步驟。根據原始樣品的種類和核酸產物后續的各種應用目的,細胞裂解和核酸純化步驟有不同的處理方法和要求。
一、實驗室中的DNA提取:
案例一:小鼠基因型判定實驗的模板DNA提取
初始樣品為小鼠尾切段?;蛐团卸▽嶒瀸NA模板的濃度、純度要求不高,消化提取過程相對簡單。
實驗步驟:
1.將1cm尾巴切段置于1.5mL微量離心管中,加入適量裂解液(Lysis buffer)和蛋白酶(Proteinase K)于55~65℃水浴過夜消化。
2.充分消化后的尾巴樣品加入沉淀液(Precipitation buffer)后用旋渦混勻器來使雜質蛋白充分沉淀,雜質沉淀后通過離心操作(如4℃,4000Xg,5min),取出溶有目標DNA的上清液,丟棄雜質沉淀。
3.上清液中加入100%異丙醇,小心顛倒離心管30~40次,便可以將產物DNA沉降。離心操作(4℃,10000Xg或12000rpm,10min)去除上清。
4.用75%乙醇洗滌兩次DNA產物,待乙醇充分揮發后,用水或TE緩沖液(Tris-EDTA buffer)收獲DNA模板產物。
進行后續的PCR擴增實驗前,可以使用Nanodrop儀器來進行DNA濃度和純度的測定來提高PCR反應的成功率。在PCR擴增實驗不順利的情況下,也可以進一步對DNA產品的完整度進行檢測,具體方法可以參考核酸檢測和核酸擴增的有關內容。
案例二:用于重組的質粒DNA提取
用于重組的質粒對DNA產物的濃度、純度和完整度都要求較高,否則無法成功完成質粒酶切和酶連的步驟。
實驗步驟:
1.從含有過夜培養大腸桿菌的試管中取出適量菌液置于微量離心管中,低速離心(4000Xg, 5min)處理后收獲大腸桿菌,除去培養液。
2.使用質粒提取試劑盒(Plasmid DNA extraction kit)提取大腸桿菌質粒。原理菌體裂解后,加入中和液(Neutralization buffer)過微型柱,使DNA特異結合于柱上,而其他雜質會過柱洗脫。最后用洗脫液(Elute buffer)洗下DNA即可得到質粒DNA產物。
3.經試劑盒提取后的質粒DNA有時需要經電泳切膠回收的操作將目標質粒DNA與其他DNA分離。切下的膠消化后經DNA純化試劑盒純化即可得到純度較高的目標質粒DNA。具體的內容可以參考核酸檢測的有關內容。
二、實驗室中的RNA提取
[ RNA Extraction: Principle, Procedure, Protocol and Importance – Genetic Education]:
RNA提取過程與DNA類似,也是通過裂解細胞后通過有機溶劑(苯酚、氯仿、異戊醇)沉降雜質的方法來分離RNA。但RNA的穩定性比DNA低很多,因此對RNA提取對溫度和污染清除的要求更高。實研操作一般從以下幾個角度來提升成功率:降低RNA水解酶活性、提升RNA穩定性、使RNA與DNA和蛋白分離、僅沉降RNA、有效去除DNA。
案例一:總RNA提取
實驗步驟與DNA提取類似,但有機溶劑的使用會有所不同。在首次離心后,混合物會分為三層,RNA溶于上層無色水相,而DNA和蛋白會處于中間層,組織殘渣等雜質處于底層酚-氯仿相中2。
實驗步驟:
1.向提取樣品中加入裂解液(如Trizol),裂解細胞與組織,室溫靜置5-8分鐘。
2.加入氯仿,充分混勻后離心(4℃,12000rpm,10min),取出上清液。
3.向上清液中加入異丙醇沉降RNA,并離心(4℃,12000rpm,10min)棄去上清。
4.用75%乙醇洗滌產物兩次,待乙醇揮發后加入RNase-free水溶解產物。
實驗中用到的耐思耗材和儀器:
槍頭、微量離心管、(15、50mL)離心管、迷你旋渦分離器(105003)。