干貨 | 皮下成瘤實驗解析
手拿把掐教你使用基質(zhì)膠!
GelNest?基質(zhì)膠是由小鼠腫瘤組織中提取的基底膜成分制備而成,包含的主要成分有層粘連蛋白、IV型膠原蛋白、硫酸肝素糖蛋白等。這些成分可以提供細(xì)胞黏附、分化和增殖所需的支持和信號,同時也可以模擬生理環(huán)境中基底膜的特性,提高細(xì)胞培養(yǎng)的成功率和效果。除了基底膜成分,GelNest?基質(zhì)膠中還富含多種生長因子。這些生長因子可以促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖和遷移,從而進(jìn)一步模擬生理環(huán)境中的細(xì)胞信號通路和互動。
GelNest?基質(zhì)膠具有廣泛的應(yīng)用前景,特別是在組織工程、細(xì)胞培養(yǎng)和研究等方面,可被用于類器官培養(yǎng)、干細(xì)胞分化、血管生成、遷移或侵襲和體內(nèi)腫瘤發(fā)生等研究。
本文針對基質(zhì)膠在裸鼠皮下成瘤實驗中的應(yīng)用方法進(jìn)行解析。
概述
皮下成瘤實驗一般選用4-8周齡的小鼠。倫理學(xué)通常要求接種腫瘤細(xì)胞數(shù)量不可超過1×107個/只。成瘤速度根據(jù)細(xì)胞的成瘤性、增殖速度、細(xì)胞接種量、小鼠品系等因素有所差異。藥物干預(yù)周期一般為0.5-2個月。
裸鼠是由于nu基因有獨特的遺傳特性,成為科學(xué)研究中具有巨大潛力的試驗?zāi)P汀=?jīng)過世界各國實驗動物遺傳育種學(xué)家的努力,已將nu基因?qū)氩煌幌祫游铮蔀橄盗袆游锬P停瑑H小鼠模型一種,已建立了二十余種近交系裸鼠。
常見成瘤細(xì)胞
較容易成瘤的細(xì)胞:
Hep-G2(肝癌),Hep2(喉癌),NCI-H460(大細(xì)胞肺癌), A431(表皮癌),SK-OV-3(卵巢癌),MCF-7(乳腺癌)SKBR3, A375/B16-F10(人黑色素瘤細(xì)胞),SGC7901 人胃腫瘤細(xì)胞 ,KB人口腔表皮樣癌細(xì)胞
可以成瘤但是比較慢的細(xì)胞:
CNE(鼻咽癌),A549(肺癌), SPC-A-1(肺腺癌), HT-29(結(jié)腸癌),BEL-7402(肝癌),MDA-MB-231 乳腺癌 , CT26 (小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞 ),SH-SY5Y (人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 ) , U251 (人膠質(zhì)瘤細(xì)胞) , BGC-823(人胃癌細(xì)胞) ,PC-3 (人前列腺癌細(xì)胞)
一些比較有爭議的細(xì)胞:
Hela(宮頸癌),HCT(人回盲腸癌細(xì)胞/人結(jié)直腸癌腺癌細(xì)胞)。
其他:
BMSC(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)
操作流程
(以Hep-G2細(xì)胞為例)
01
將Gelnest?基質(zhì)膠(高濃度)置于冰中并在4℃過夜融化,使用預(yù)冷的移液管或吸頭混合基質(zhì)膠至均勻狀態(tài)。
注:高濃度低因子基質(zhì)膠的成瘤更快。
02
細(xì)胞收集:準(zhǔn)備對數(shù)期生長的、細(xì)胞密度達(dá)80-90%左右的Hep-G2細(xì)胞,于收集細(xì)胞前一天晚上更換新鮮培養(yǎng)基。胰酶消化細(xì)胞,待細(xì)胞變圓未脫離培養(yǎng)皿時,去除胰酶,加入無血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。收集的細(xì)胞懸液300×g離心5分鐘,PBS洗滌2次。PBS重懸細(xì)胞至終濃度為8×10^7個細(xì)胞/mL。將細(xì)胞置于冰上待用。
注:1.懸浮細(xì)胞直接收集細(xì)胞懸液,貼壁細(xì)胞用胰酶消化后收集細(xì)胞懸液。
2.收集的細(xì)胞宜在1小時內(nèi)接種完畢。
03
將細(xì)胞懸液與基質(zhì)膠在4℃環(huán)境下按照1:1的比例混勻,制備成終濃度為0.5×10^7-5×10^7個細(xì)胞/mL。
注:細(xì)胞懸液與基質(zhì)膠混合液需置于冰上以減緩細(xì)胞凋亡并防止基質(zhì)膠凝固。
04
使用實驗動物電動剃毛器對小鼠注射部位皮膚進(jìn)行脫毛,然后用酒精棉球進(jìn)行消毒。
消毒
05
用不帶針頭的1mL注射器將細(xì)胞懸液與基質(zhì)膠混合液吸入注射器,再裝上針頭。
注:吸取混合液前可用注射器緩慢吹打以混勻細(xì)胞。
06
左手抓取固定裸鼠,于裸鼠左側(cè)腋窩處皮下注射,接種時,針頭在皮下進(jìn)針深一點,約1cm深,以減少注射后細(xì)胞懸液從針眼溢出。接種體積通常為100μL/只。
注:這一過程盡量在半小時內(nèi)完成,途中細(xì)胞懸液放在冰上以減緩細(xì)胞凋亡及防止出現(xiàn)凝膠現(xiàn)象。
排空入針口
接種
接種后觀察
07
將裸鼠放回籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng),約1-3周可觀察到較明顯的瘤塊,并根據(jù)實驗設(shè)計在腫瘤體積不超過1000mm^3前對裸鼠進(jìn)行安樂死,取出腫瘤,拍照。
腫瘤測量
腫瘤活體熒光
常見問題與解答
Q1:常見的荷瘤不成功可能的原因?
A:
(1)細(xì)胞的狀態(tài)是成瘤實驗的關(guān)鍵,所以細(xì)胞生長狀態(tài)一定要好,取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,細(xì)胞達(dá)80-90%左右密度為宜,收集細(xì)胞前一天晚上更換新鮮培養(yǎng)基。需加入基質(zhì)膠輔助或增大接種量或更換細(xì)胞系;
(2)可能是小鼠周齡太大,一般選擇5-6周齡裸鼠,小于4周可能不耐受過早死亡,大于6周免疫力會增強(qiáng),不易成瘤。
(3)可能是小鼠免疫排斥,建議更換免疫缺陷程度更大的小鼠(NSG(包括NOG、NCG,B-NDG等)>Nod-scid小鼠>Nude裸鼠)。
(4)接種部位也是成瘤實驗的重要因素。選擇血管豐富且易操作的部位接種,如腋下、腹股溝、側(cè)腹部及頸背部等部位,其中腋下中后部皮下較好,成瘤率高,比較推薦打腋下,一人操作很方便,后續(xù)量瘤子也很好操作。
Q2:腫瘤長起來后又消失的原因?
A:腫瘤生長過程中,如果出現(xiàn)腫瘤塊先縮小,后變大的現(xiàn)象,很可能是由于炎癥反應(yīng),腫瘤細(xì)胞被小鼠自身吸收造成的。
繼續(xù)觀察腫瘤細(xì)胞吸收之后是否經(jīng)過幾周還能長出來,如若后續(xù)腫瘤依舊未長出來,可考慮更換免疫缺陷程度更大的小鼠。
Q3:造成腫瘤均一性很差的原因?
A:首先,并不是所有的腫瘤都能夠長得均一形態(tài)。腫瘤生長不宜過大,一般直徑不超過15mm,體積不超過2000mm^3
其次,如果同一分組內(nèi)小鼠腫瘤體積差距很大,可能是由于小鼠的周齡及接種細(xì)胞量不一致造成的,建議重新接種。
Q4:是否可以應(yīng)用免疫抑制劑加速腫瘤生長?
A:一般不建議加免疫抑制劑,有限考慮選擇免疫缺陷程度更高的小鼠品系。
一、質(zhì)量控制介紹
二、選用指南
三、儲存及操作注意事項
GelNest?基質(zhì)膠在分裝前可以保存于 -20℃冰箱。初次使用時,應(yīng)融化后按照單次用量分裝,并保存于 -80° C 冰箱,有效期 2 年。注意不要使用無霜冰箱儲存 GelNest?基質(zhì)膠。
GelNest?基質(zhì)膠在 4℃下呈液態(tài),在 37℃時會形成凝膠態(tài),在溫度高于 10°C 時就會開始凝固成膠,請預(yù)冷移液吸頭并盡量在冰上操作。